又一次考验来临。1937年7月7日，抗日战争全面爆发。芦沟桥事变十天后，1937年7月17日，蒋介石在庐山发表讲话，宣布奋起抵抗。他说：“我们希望和平，而不求苟安；准备应战，而决不求战。我们知道全国应战以后之局势，就只有牺牲到底，无丝毫侥幸求免之理。如果战端一开，那就是地无分南北，年无分老幼，无论何人，皆有守土抗战之责，皆应抱定牺牲一切之决心。”
8月，各省军政长官齐集南京开会应变，龙云乘专机到达。在国共内争中，龙云尽量置身事外，以保存实力和维护他治下的云南相对独立地位；但在抗战问题上，虽然也时常有疑虑和防范,他的确做到了先国后己。蒋介石要求云南出两个军,龙云当场表态：“可以办到。但只能先出一个军，另一个军要看战争的情况再定。”蒋介石对此答复很高兴。两人在南京商谈中一致认为沿海地区难保，西南国际交通线必依赖西南。龙云提出赶修滇缅公路和滇缅铁路，直通印度洋，公路修筑由云南负担，中央补助；铁路修筑由中央负责，云南协助。蒋介石连声称好。
龙云一回云南，即召开军政人员会议通报情况，他说，“日本是真的干起来了”，“局势是很危急的，我们要迅速充分准备”。
他按照承诺，回滇后即派卢汉率一个军出发抗日；1938年初，又派出孙渡率一个军出省。派出参加抗战的都是滇军精兵强将，他们转战千里，在台儿庄、禹王山等战役中浴血奋战，寸土不让，痛歼来寇，日本报纸惊呼：“遇到滇军这样猛烈冲锋，置生命于不顾，实为罕见。”
据统计，八年抗战，滇军经历各重大战役二十余个,伤亡官兵共计十余万人。云南地处大后方，龙云知道战事一开，云南必成重镇，粮食供应是头等大事，而云南素来稻米不能自给。早在1931年东北事变时，他就开始办理“积谷\"，也就是储备粮食，到1937年夏，积谷已有相当规模。
抗战中，云南境内大军云集，进人滇境的部队有第二军、第五军、第六军、第八军、第五十二军、第五十三军、第五十四军、第六十军、第六十六军、第七十一军、第九十三军等十多个军，人数达数十万；另有美军及技术人员两万多人。同时，内地的机关、学校、工厂源源迁来；缅甸沦陷后，又有大批华侨回国。云南境内人口陡增一百多万，占原人口总数的十分之一。由于龙云着手准备得早，粮食供应基本未出现危机。即便是消费力极强的美军，他们需要大量猪鸡之外，每天还要消耗六万多枚鸡蛋和百余条菜牛，在邻省四川、贵州的协助下，也基本供应充足。
多年之后，谈起积谷之功，龙云欣慰而自得。修通滇缅公路，是云南在抗战中为国家立下的又一大功。到20世纪30年代初，云南还没有一条通往外省的公路；到1937年，通往四川、贵州的滇东公路才通车。1937年8月20日，日本海军省宣布封锁中国沿海，防止其他国家援助中国抗战的物资入境。1937年12月，至关重要的
滇缅公路动工修筑。
滇缅公路北起昆明，南至缅甸腊戌，全长一千一百四十六公里，其中中同境内九百五十九公里。在群山起伏、河流纵横的恶劣地理条件下，云南各族人民日夜奋战，平均每天出工十万人，有时达到二十万。他们自带干粮和工具，只靠手挖肩扛，使这条抗战生命线迅速向境外延伸。由于劳作艰苦，加之工地疫病流行，修路过程中民工伤亡上万。
短短八个月，1938年8月，滇缅公路中国段全线修通。仅下关到畹町的五百五十公里，就完成土方一千一百多万方，石方一百多万方；这一段有大桥五座，中桥二座，小桥二百三十六座，涵洞一千七百八十九个。
通车后国际对是否真在这么短的时间内修通了滇缅公路将信将疑，美国总统罗斯福派驻华大使詹森亲往考察。看着蜿蜓在险山恶水间、宽五到十米的泥结碎石公路，詹森感叹，这真是“世界之奇迹”，“可与巴拿马运河媲美\"。而英国《泰晤士报》连续三天刊登报道和照片，称这条公路的修通“只有中同人可以做得到”。
得到詹森的汇报,美国政府决定，以后援华物资就从这条路输人。仅1941年,从滇缅公路运到中国的物资就达十三点二万吨；1942年初，缅甸沦陷前，又有囤积在缅甸的八万吨物资通过此路抢运到中国；中国入缅作战的十万远征军也从此路输出。
抗战中龙云不计代价，尽力而为，连出征滇军的费用，都由云南地方财政承担。他说：“滇军一枪一弹，都来自云南人民。”