迈过50岁门槛的伊莎贝拉·德·埃斯特开始投掷她人生中决定最后胜负的骰子。都说“曼托瓦侯爵的价值很少”，在过于著名的母亲之下，玩世不恭的儿子费代里科只是在情人伊莎贝拉·博斯凯蒂的怀中寻求慰藉，并不值得一提。伊莎贝拉的决战对手是“罗马劫掠”之后几乎贯穿了意大利历史的西班牙国王——神圣罗马帝国皇帝卡洛斯。现在，所有的事情都取决于他的意志。她冷静地计算着卡洛斯的实力，在不让对方察觉的情况下利用他的实力来为自己做必要的准备。
“罗马劫掠”事件使得天主教帝国的皇帝卡洛斯受到了舆论的谴责。皇帝明白不能总将教皇放置于如此屈辱的状态之中，必须求得和解。现在，问题转移到了卡洛斯这边。
不过，挫败了法国的野心并将那不勒斯与米兰都收入囊中，可以说卡洛斯获得了完美的胜利。1529年8月12日，他第一次将脚踏进意大利的国土——热那亚，为了实现他长年的期望——在罗马，让教皇用双手为他戴上神圣罗马帝国皇帝的皇冠。可是，意大利人并没有忘记两年前的“罗马那桩恐怖事件”。出于这一考虑，教皇与卡洛斯会见的地点选择了罗马与热那亚中间的博洛尼亚。意大利各地的贵族们陆陆续续前往博洛尼亚。伊莎贝拉没有理由错过这一机会，11月，她也带领着那些美丽的女官前往博洛尼亚。
伊莎贝拉此行的目的有三个。首先，将曼托瓦的侯爵地位升级至公爵；其次，如果顺利的话，以当今米兰公国的国主、外甥弗朗切斯科·斯福尔扎的病体为由，将米兰与曼托瓦合并；最后，因为弟弟阿方索·德·埃斯特的费拉拉公国与历代教皇之间关系不和，所以希望借卡洛斯的力量进行消解。为此，阿方索与伊莎贝拉之间经常信函来往，商量计策。
1529年11月，在16位枢机主教的陪伴下，教皇克莱芒七世与另一位也是威风凛凛的、在盛大队伍陪伴下驾着马的卡洛斯，先后进入博洛尼亚城。从这个时候起，西班牙风格的黑白色服饰取代了迄今色彩鲜艳的文艺复兴风格。这似乎也象征着意大利文艺复兴的崩溃。
翌年2月22日，神圣罗马帝国皇帝的皇冠经教皇之手，光辉灿烂地戴到了卡洛斯的头上。每天晚上，贺宴舞会不断。在那之间，伊莎贝拉的愿望基本也都一一实现了。公爵晋升一事已经获得了卡洛斯皇帝的许诺。不过，关于米兰公国合并一事，因为皇帝对米兰公爵弗朗切斯科·斯福尔扎的亲爱，而没有希望实现。费拉拉与教会之间的和解也完全达成了。卡洛斯在加冕仪式之后，不顾教皇的反对，立即将阿方索·德·埃斯特叫到罗马。阿方索是卡洛斯在意大利贵族之中唯一认可的具有统治能力的男人。3月初，急忙赶到罗马的阿方索与教皇和解了。
但是，这一次，伊莎贝拉的女官们又发生了绯闻。西班牙与意大利的骑士们为了她们而争斗，结果一个晚上死了14个人。伊莎贝拉不得不火速带领女官们离开博洛尼亚。尽管如此，年轻的卡洛斯皇帝依然对伊莎贝拉从心底里怀着善意与近乎尊敬之情。他夸赞了她的儿子们，据说在西班牙的宫廷里，卡斯蒂利奥内一直向他讲述伊莎贝拉的事情，于是他答应在归途中顺便去一下曼托瓦。
3月25日，顺路经过曼托瓦的卡洛斯将费代里科晋升为公爵。长子获得了公爵的头衔，次子埃尔科莱升为枢机主教，三子费兰特已经被送至卡洛斯的宫廷，这时伊莎贝拉的身边传来了消息：代替奥朗热公爵指挥皇帝军队的费兰特攻陷佛罗伦萨。被视为文艺复兴发祥地的佛罗伦萨共和国，在这一年瓦解了。
皇帝在离开曼托瓦之前，为费代里科订下了婚约。曼托瓦公爵已经30岁了，17岁的时候与当时8岁的玛丽亚订了婚，但是他为了情人伊莎贝拉·博斯凯蒂，向教皇请求婚姻无效，并获得了许可。无效的理由据说是玛丽亚的母亲蒙费拉托侯爵夫人指使伊莎贝拉·博斯凯蒂的丈夫预谋毒杀费代里科与伊莎贝拉·博斯凯蒂，伊莎贝拉·博斯凯蒂的丈夫也因这莫须有的罪名被杀害。如今，曼托瓦现任国主费代里科的婚姻是政治婚姻，费代里科与伊莎贝拉·博斯凯蒂都明白这一点，所以她彻底放弃了自己成为公爵夫人的念想。
那时，皇帝传来了话，选定的新娘是朱莉娅公主。她是阿拉贡家族中唯一生存的王室女儿，相当于费代里科的表姐。朱莉娅长得很难看，而且已经40岁了。费代里科就连假装接受也不愿意，但伊莎贝拉·博斯凯蒂却建议他结婚。她打的算盘是，朱莉娅是一个又丑又老的女人，所以不可能给费代里科生下孩子，而且他也不会爱上她。这样一来，自己的孩子就能成为继承者。伊莎贝拉默不作声地看着伊莎贝拉·博斯凯蒂的这一举动，没有采取行动，她在等待着时机。
可是，这个时机却来得意外的早。年幼的蒙费拉托侯爵从马上摔下来，突然去世了。于是，继承权就转到了女儿玛丽亚的身上。感到一切都提早了的是费代里科，他赶紧向教皇与皇帝寄去信函，请求说他有不能与朱莉娅结婚的理由。因为之前与未婚妻玛丽亚的婚姻无效的手续还没有办好，所以与朱莉娅的订婚是无效的。皇帝与教皇都大为震惊，不过还是将决定延期了。接着玛丽亚也去世了，而继承者这次变成了她的妹妹玛尔格利塔。
到了这个时候，伊莎贝拉终于开始有所行动。年轻的继承者玛尔格利塔的身边，来自各地的求婚蜂拥而至。母亲蒙费拉托侯爵夫人希望女儿与米兰公爵弗朗切斯科·斯福尔扎结婚，米兰公爵也是如此希望的。伊莎贝拉首先去说服母亲侯爵夫人。在伊莎贝拉出色的外交面前，侯爵夫人根本不是对手。伊莎贝拉甚至说，“只要女儿同意的话”，立刻将费代里科派到玛尔格利塔的身边。在费代里科巧妙的求爱下，玛尔格利塔被俘获了。她说：“如果不能与费代里科结婚，那我就去当个修女。”伊莎贝拉同时还向教皇和皇帝采取了行动，贿赂了听取费代里科忏悔的牧师，让他在复杂宗教的教义之上编写戏剧。其理由是：因为之前婚约无效时的忏悔不合教理，所以婚约无效不成立。对此，教皇与皇帝都不得不同意。而且，订了婚的姐姐死后由妹妹替代，这样例子也不是很少见。1531年7月，费代里科·贡扎加与玛尔格利塔的婚事对外宣布。11月，年轻的新娘到达曼托瓦。三年后，蒙费拉托侯国与曼托瓦公国合并。
伊莎贝拉·博斯凯蒂的一切希望都落空了。10年的情人费代里科为了这桩婚姻抛弃了她，虽然不至于被流放，但她留下了孩子们后离开了曼托瓦。伊莎贝拉也许胜利了，但她在这10年来的敌人伊莎贝拉·博斯凯蒂的身上看到了与自己相似的特征。
对于伊莎贝拉·德·埃斯特来说，儿子费代里科的婚事是她生命中最后的政治行为。年近60岁的她，在去世前的9年中，很多时候都在自己的书斋里静静地度过。宫殿中有两个被称为“洞穴”（GROTTA）与“书斋”（STUDIOLO）的房间，里面用收集而来的众多艺术品点缀着，虽然小却有一个面向中庭的大窗户，充足的阳光就从那里照射进来。
1534年，弟弟阿方索去世。接着，米兰公爵、乌尔比诺公爵以及与她同时代的人，几乎都不在了。世代变更，但伊莎贝拉深以为豪的精神独立并没有表现出一丁点儿衰弱的迹象。虽然女儿埃莱奥诺拉、儿子埃尔科莱等人已经成为维多利亚·科隆纳的沙龙中热心的一员，但是，伊莎贝拉与维多利亚·科隆纳的“宗教般清洁的精神结合”完全无关。
正如书斋的入口处挂着的她的座右铭“无望无惧”所显示的一般，对于伊莎贝拉来说的人生，就是那里，眼前就是人生。即便那并不是纯洁的、美丽的。她虽然对维多利亚·科隆纳彬彬有礼，但那并非尊重她的“高贵的精神”，而是因为维多利亚的外甥是当时最有势力的阿方索·德·阿瓦洛斯（Alfonso d\' Avalos）。如同伊莎贝拉期望的那样，这个西班牙贵族后来与伊莎贝拉的孙女结婚了。
伊莎贝拉的“书斋”
《伊莎贝拉的“书斋”》，总督府（曼托瓦/意大利）©Archivi Alinari, Firenze
最后的几年，伊莎贝拉将热情都倾注于一个名叫索拉罗洛（Solarolo）的小地方的统治上。她如其所愿地对这个位于罗马涅地区的小城市进行管理，进行清晰的行政区划，征收合理的税款。现在从博洛尼亚往里米尼去的路上，稍微偏离一点儿的地方有一个小镇，镇上的中心广场被称作贡扎加广场。
她的这一统治受到了高度评价，人们都称赞道：“这是一位应该生为女王的女士。”可是，这其实也是伊莎贝拉被儿子费代里科从曼托瓦国政中隔离出来后对寂寞的逃避。但是，她没有抱怨，也从未想过取代儿子，因为她觉得已经为曼托瓦做了她应该做的一切。即使到了这个年纪，她依旧是一个快活的，而且非常时髦的女人。
1537年6月，伊莎贝拉仅有的几个同世代的朋友中的一位、老友枢机主教彼得罗·本博到曼托瓦来拜访她。在他滞留的5天中，参观了她那个现在被称为“天国”的艺术品书斋。曼特尼亚、柯勒乔、贝里尼、提香的绘画，米开朗琪罗的雕刻，希腊的大理石像及古罗马诸多的雕刻上都印满了她的回忆。本博与依旧拥有年轻而生气勃勃的精神的伊莎贝拉度过了一段难忘的日子。带着这个深刻的印象，他离开了曼托瓦。数日后，伊莎贝拉的儿子埃尔科莱收到了来自本博的一封信。“您有一个非常优秀的母亲。伊莎贝拉·德·埃斯特是我们这个时代最贤明和幸福的女士。”
两年后，1539年2月13日，伊莎贝拉去世，时年65岁。