伊莎贝拉·德·埃斯特现在已经完全融入意大利文艺复兴风格的和谐之中。意大利文艺复兴风格的和谐即精神与肉体、善与恶的明快而又感性的、性感的共存。
在意大利文艺复兴时期还没有像新教徒那样的见解，即认为精神的东西与肉体的东西之间不存在纠葛。那充其量是不具有将二者区分开来分析的人文主义传统的北方新教徒式的看法，是萨伏那罗拉对其夸大的评价，也是对当时教皇们的堕落一言以蔽之的理由之一。在意大利，这两种东西在人的身上得以调和共存。换言之，意大利文艺复兴的真髓，不是封闭于狭隘的精神主义外壳之中的东西，而在于无可匹敌的大胆魄力与透彻的理性精神，并立足于此将情感与肉体调和统一。如果不能理解到这一点，那意大利文艺复兴的情调将无从谈起。从30岁的后半到40多岁，伊莎贝拉·德·埃斯特也更加深刻地融入这样的意大利文艺复兴情调之中。
在确保丈夫的自由与曼托瓦的安全之后，伊莎贝拉·德·埃斯特平静的日子并没有持续多久。教皇尤利乌斯二世改换了敌人，将威尼斯换成了法国。教皇首先瞄准的是与法国关系密切的费拉拉，也就是伊莎贝拉的弟弟阿方索·德·埃斯特统治的费拉拉。这一次，她千真万确地不得不应对这场亲属间的战斗。
1511年，教皇的军队从博洛尼亚向着费拉拉进军，军队由乌尔比诺公爵与弗朗切斯科·贡扎加率领。弗朗切斯科被释放后就被教皇任命为教皇军队的指挥官。如今，自己的丈夫与女婿去攻打自己的弟弟阿方索，这让伊莎贝拉痛苦不堪。教皇军队很轻松地拿下了费拉拉的领地摩德纳与米兰多拉，但阿方索拼死也想守住费拉拉。
伊莎贝拉又一次变卖自己的珠宝，贿赂了医生。她让医生写下了诊断书：作为教皇军队的指挥官而加入费拉拉进攻战役的曼托瓦侯爵弗朗切斯科·贡扎加，因为此前俘虏生活过度疲惫而患病，不能继续执行军务。伊莎贝拉的计划成功了，毫不知情的丈夫被撤离战线。或许是因为这个原因，前来支援费拉拉的法国军队成功地将教皇的军队赶回了博洛尼亚。眼看时机成熟，伊莎贝拉提议休战，还提出需要英国、法国、德国、西班牙的大使们在曼托瓦就这一事件进行会谈。教皇尤利乌斯二世的野心未能得逞，被击溃的军队返回了罗马。
8月，在曼托瓦召开了由伊莎贝拉组织的会议，欧洲各国的大使们与意大利各国的代表汇聚一堂。已经37岁的伊莎贝拉依旧充满了魅力。她不仅具有闻名整个欧洲的修养和知性，而且，在中年时原本活泼而机敏的性格更获得了成熟与精炼，使得她浑身透出一种优雅的气质。代表西班牙的那不勒斯总督几乎被伊莎贝拉的魅力迷得神魂颠倒。她还有更深远的考虑。在会议的间隙或者晚上接连不断地举行舞会与音乐会，从曼托瓦宫廷里精挑细选出的美女们华丽地点缀其间。
会议按照伊莎贝拉的意图进行着。费拉拉正是因为没有可靠保障，才变成今日这个现状。再加上米兰自1499年以来，隔了11年之久才回到斯福尔扎家族的手上，回到贝亚特丽斯与伊鲁·摩洛的儿子马西米利亚诺的手上。米兰完全是意外的收获。神圣罗马帝国皇帝马克西米利安与西班牙国王费迪南多二者都希望将米兰公国送给孙子卡洛斯，但是遭到了教皇的坚决反对。威尼斯与其他意大利诸国也都赞同教皇的意见。利用了这一对立，马西米利亚诺才得以进入米兰城。当然，这也受到了伯母伊莎贝拉巧妙的帮助。
在罗马，教皇尤利乌斯二世正处于垂死之际。1513年2月20日，这个因为自己的感情而实话实说，常常会因为过于愤怒而暴粗口的充满人性的教皇，这个将教会变得强大，努力保卫意大利不落入外国人之手的唯一的教皇尤利乌斯二世去世了。教皇理解并赞同伊莎贝拉，认可了她，尽管他常常会怒喝其为淫妇。但伊莎贝拉却没有理解尤利乌斯二世崇高的志向，对她而言，统一意大利等与她完全没有关系，曼托瓦与费拉拉才是重要的。所以，与得知教皇死讯而欢喜的阿方索·德·埃斯特一样，她也松了一口气。因为这样一来，儿子费代里科就能回到曼托瓦了。
那时，伊莎贝拉正住在米兰宫廷。为了帮助外甥马西米利亚诺即位米兰公爵，也为了直接从德国、西班牙等国获得保障以保卫费拉拉的平安，她重施故技，调动了美女女官。
成为米兰公爵的马西米利亚诺虽然年满19岁，但是长期以来瑞士的流亡生活在这个青年的身上落下了惨痛的阴影。他怎么也不会笑，只有对着侏儒和小丑时，他才会显示出好像一个孩童的兴趣，和他们在一起才会开心。至于统治米兰公国之类对他完全没有吸引力，他的一些古怪的举动不是让人们感到惊异，而是觉得可怕。伊莎贝拉对这个外甥也没抱任何期望，她考虑的是，既然可能近期就会失败，那就必须提前做好之后的准备。
可是，那个时候，让她困扰不堪的是自己的女官们与滞留于米兰的各国大使之间的绯闻。此前在曼托瓦成功的这个方法，现在在米兰却有点儿过头了。伊莎贝拉不得不解雇了一个女官，她与西班牙的那不勒斯总督之间的流言传得太厉害。这个女官被送到戈伊托附近的一个修女院，在那里作为总督的情妇生活着。
听到这一传闻的弗朗切斯科大怒。他给伊莎贝拉去了一封信。“对这样一个什么都自以为是的妻子，我深感耻辱。”弗朗切斯科自从因妻子的计谋而被撤离战场起，就变得体弱多病而过着死气沉沉的生活。于是，他非常不痛快地盯着妻子浮夸的政治行动。而且，更为重要的是，他忘不了在自己被俘期间妻子的做法。作为一国国主姑且不论，即便从个人感情来说也是无法释怀的。于是，他的不满便在此时爆发了。伊莎贝拉立刻写了回信。“米兰发生的丑闻，确实可以说是我的责任。但是，这是我为了曼托瓦，为了费拉拉而做出的举动。比起一个丈夫娶了怎样的妻子来说，你更应该向我表示感谢。就算你爱我，敬重我，对迄今我所做的事情，你也不可能回报得了。”（1513年3月11日）在这封信中，她没有像以往那样署名“你的妻子伊莎贝拉”，而代之以“曼托瓦侯爵夫人”。
伊莎贝拉失去了丈夫的爱，在失去的同时，她自己也切断了对丈夫的爱。现在曼托瓦已经没有什么可以做的了，丈夫弗朗切斯科正将自己疏远国政，而40岁的她对政治也感到一丝疲惫。她决定出去旅游，前往向往已久的罗马。
罗马是一个大都会，古老富饶而又十分繁华，这一切立刻俘获了伊莎贝拉。因为新教皇利奥十世曾邀请过她，所以这一次整个梵蒂冈都对她相当热情。伊莎贝拉在罗马找到了她所有的旧友。以前出入曼托瓦宫廷的毕比印纳成了枢机主教，诗人本博也在。在到达罗马之后的6个星期中，她一心埋头于游览古罗马的遗址与梵蒂冈。
以前从克里斯托弗·罗马诺及本博等人的口中，从儿子费代里科年轻感动的语言中幻想出的罗马，直到此时，伊莎贝拉才第一次亲眼看见。她也见到了《廷臣论》的著者卡斯蒂利奥内、毕比印纳称赞的米开朗琪罗的《创世纪》、优雅完美的拉斐尔的壁画。本博、毕比印纳枢机主教、萨多莱托、卡斯蒂利奥内为她做了向导。拉斐尔也很高兴为她向导了自己亲自担任发掘指挥的“提图斯浴场”与尼禄的“黄金宫殿”遗址。其间，他们夜以继日地为她举办舞会及音乐会。梵蒂冈以她为主宾上演了毕比印纳枢机主教创作的戏剧《卡兰德利亚》，教皇也出席了。
1515年的狂欢节临近了。可是，想要观看当时首屈一指的华丽的罗马狂欢节的伊莎贝拉，迫于丈夫的命令不得不回国。教皇希望她留在罗马的关怀也落空了，她恋恋不舍地离开了罗马。在抵达曼托瓦的当夜，她立刻给毕比印纳枢机主教写了一封信。“为了履行对丈夫的义务，我现在回到了曼托瓦。但是，在这个小小的房间里的无聊生活更让我无法忘记在罗马的梵蒂冈那间大厅和那些无与伦比的日子。我的身体虽然回到这里，但心依然留在那里，留在了罗马。”
可是，伊莎贝拉并没有时间去无尽地感伤，因为洛伦佐·德·美第奇的次子利奥十世教皇开始扶植自己的美第奇家族。乌尔比诺的国主即前任教皇尤利乌斯二世的外甥弗朗切斯科·马里亚·德拉·罗韦尔突然被逐出乌尔比诺公国，乌尔比诺交到了教皇的弟弟朱利亚诺·德·美第奇的手中。尚在病中疗养的朱利亚诺从前与乌尔比诺公爵一家及曼托瓦的贡扎加家族关系亲密，所以这不是他所希望的。两个月后，朱利亚诺死了，教皇立刻让其外甥洛伦佐·德·美第奇继任乌尔比诺公爵。到了这个时候，教皇已经完全忘记了对伊莎贝拉的友情。他将前任乌尔比诺公爵夫人即伊莎贝拉的女儿驱逐出境，没有丝毫犹豫。
1519年，神圣罗马帝国皇帝马克西米利安去世。他的孙子查理五世（他也是西班牙国王卡洛斯一世）马上即位，全权统治德国、西班牙、荷兰及那不勒斯。法国进入了年轻的弗朗索瓦一世的时代。
3月，曼托瓦侯爵弗朗切斯科垂死躺在床上。29日的早上，他传唤了公证人。他将曼托瓦侯国的继承权交给了费代里科，另外两个儿子埃尔科莱与费兰特分别得到8000达克特的年薪。他给进入修女院的两个女儿以3000达克特的陪嫁金，给两个庶出的女儿每人400达克特。给妻子伊莎贝拉一份属于她个人的财产，保证每年能获益1.2万达克特。他向弟弟枢机主教西吉斯蒙多与乔凡尼·贡扎加托付了遗言执行的责任，请他们在费代里科年满33岁之前对国政给予协助。女儿埃莱奥诺拉嫁给了乌尔比诺公爵，对流亡的他们一家每年给予6000达克特的资助。吩咐完了之后，弗朗切斯科让人叫来妻子与孩子们，向站在床铺周围的他们辞行。他把自己的头发给了费代里科，对他说要好好治理国家。最后，他见了伊莎贝拉。他将孩子们托付于她，告诉她自己信任她的知性与才能，所以非常安心。然后，他在僧侣朗读《圣经》的声音中平静地死去。
伊莎贝拉悲伤不已。她人生的所有记忆，无论是好或坏，都是与弗朗切斯科这个男人联系在一起的。在最后的几年，虽然这对夫妇失去了男女之间的爱情，但是被互相牵挂的深刻亲情相连。她委托罗马的拉斐尔设计丈夫的墓，不过因为拉斐尔的突然离世未能实现。
整个欧洲都对伊莎贝拉寄予了同情与安慰。教皇利奥十世在送去一封充满了善意温柔的信函同时，还将伊莎贝拉的友人同时也是教皇的秘书官彼得罗·本博派去曼托瓦。来自各国的吊唁不断，其中费拉拉的卢克雷齐娅·波吉亚送来一封充满了乞求原谅的悲伤心情的信函。她自己也躺在病床上，就在弗朗切斯科去世的3个月后，卢克雷齐娅也死了。
伊莎贝拉现在完全掌握了实权。费代里科年纪尚轻，两个小叔子人品也很好，而且都支持伊莎贝拉。外国来的信息都由她的友人——教皇特使弗朗切斯科·吉艾利卡提送来。还有来自伦敦的亨利八世的宫廷、来自西班牙的卡洛斯一世的宫廷的消息。这些消息准确地显示即将进入诸国兴起的新时代。尽管伊莎贝拉明白意大利外部的这种急速变化的情势，却没有做出相应的准备。现在她的愿望是希望儿子费代里科当上教皇军队的总司令官，她从未怀疑过教会势力的影响力。1521年，这个愿望在卡斯蒂利奥内的强劲后援下实现了，伊莎贝拉大喜过望。按照教皇的要求，她制作了费代里科署名的誓约书作为对教会的忠诚的证明，与梵蒂冈的重要文书一同收藏于保险箱。可是，在后来卡洛斯的大军逼近罗马的时候，伊莎贝拉又非常惊慌地想要取回这个文件。
在任命费代里科的同时，利奥十世给伊莎贝拉出了一道难题——将乌尔比诺侯爵一家驱逐出曼托瓦。伊莎贝拉断然拒绝驱逐她的女儿及伊丽莎白，侯爵无奈之下只能一个人辗转于威尼斯与维琴察。像是穷追猛打一般，教皇接着又明示了将费拉拉变成教会领地的意图。因为此前伊莎贝拉拜托罗马的卡斯蒂利奥内打听教皇的意图，所以秘密信函紧急送到了她身边，这让伊莎贝拉与阿方索坠入了绝望的深渊。
恶报接连不断，自己依赖的法国军队被赶出了米兰，而且还是费代里科指挥的教皇军队与皇帝一方的普罗斯佩罗·科隆纳联合才战胜了法国军队的罗特莱克。这个消息让罗马的教皇高兴得忘乎所以，因为他想让美第奇枢机主教成为米兰公爵。而伊莎贝拉与此相反，她支持的是伊鲁·摩洛与贝亚特丽斯的次子弗朗切斯科·斯福尔扎。似乎所有的事情教皇都得偿所愿了，但是5天后，教皇在狩猎时感染风寒，当天傍晚就死了，时年45岁。谣传他是被人下了毒，但真相并不清楚。
利奥十世在身后留下了30万达克特的欠债。不仅如此，教会的宝石、金子、教皇的三层皇冠、主教们的头冠、银制的餐具、用来装饰西斯廷教堂的昂贵的挂毯等，全被抵押了。威尼斯大使写下：“没有一个教皇像他这样在坏名声中死去的。”曼托瓦大使给伊莎贝拉写了这么一封信：“利奥十世像一只狐狸一般紧紧地抓住了权力，像一头狮子一般治理，并像一条狗一般死去。”
费拉拉的阿方索如释重负，赶紧制作了纪念章，刻下了“Ex Ore Leonis”（虎口余生）。乌尔比诺公爵得知教皇的死讯后立即返回曼托瓦，向伊莎贝拉与阿方索借了金钱与军队前往乌尔比诺。没有受到任何阻挠，在市民们的欢呼声中，他重新回到了乌尔比诺。