清军占领西安后，多尔衮命多铎按原计划移师进攻南明弘光政权，阿济格部由陕北南下追击大顺军。这时李自成正带着军队进至河南内乡一带。据说，李自成曾有意直趋南京，抢在清军之前占领东南财赋之区，由于顾君恩的竭力劝阻，才决定南下襄阳、承天。阿济格受命进攻陕北时，曾经迂道蒙古部落索取马匹，受到摄政王多尔衮的严厉训斥，责成他“将流寇余孽务期剿除，以赎从前逗留之咎。”阿济格不敢怠慢，在任命了西北地区官员之后随即率师南下。当时大顺军在数量上仍然超过清军，但是连续大败之后，士气低落，撤退时又拉家带口，行动迟缓。正月二十九日，主力撤到河南内乡后，在这里停留了较长的时间，直到阿济格部清军追了上来时，才于三月十八日拔营南下湖北。
据阿济格向清廷的报告，这年三月到四月，清军先后在河南邓州、湖北承天（钟祥）、德安（安陆）、武昌、富池口（湖北阳新县境）、桑家口、江西九江等七地，接战八次，大顺军都被击败。这里所说的八次战役，并不都是大顺军主力同阿济格部清军展开的正面交锋，但却反映了大顺军从西安撤退下来的行经路线和清军的追击情况。
三月，大顺军由承天进抵汉川、沔阳，南明镇守武昌的左良玉告急。明江西总督袁继咸以为大顺军将沿长江北岸向南京进军，就带了一部分军队赶往蕲春，同武昌的左良玉部相呼应。大顺军却从沔阳州的沙湖和对岸簰州之间渡过长江，在荆河口击败左良玉部将马进忠、王允成的驻防军，使“武岳大震”。左良玉吓得魂飞魄散，只好借着“北来太子”问题大做文章，打起清君侧的旗帜，声称要打到南京，讨伐马士英、阮大铖。左军于三月二十三日全师东下后，武昌遂无驻军，李自成乘机占领该城。
李自成当时的计划是夺取东南作为抗清斗争的基地，所谓“西北虽不定，东南讵再失之？”到达襄阳时，他麾下的士卒有从西安带来的十三万，又把原先部署在襄阳、承天、德安、荆州四府驻防的七万人调集随营，合计二十万众，“声言欲取南京，水陆并进。”李自成把襄、荆四府的驻防军调随主力东下，是因为同清军争夺南京，需要这支比较完整的生力军。但是，这次集中兵力的做法是失策的，当时负责镇守德安的大将白旺就曾提出意见，认为这些地方经过一年多的经营，已经比较巩固，驻防军也不弱，应当固守。但这个正确的建议没有为李自成所接受，白旺没有办法，只好奉命行事。所以当阿济格部清军尾追而来时，大顺军后方空虚，根本没有力量阻滞清军前进。
李自成刚到达武昌不久，清军就跟踪而至，“围武昌城数匝”。刘宗敏、田见秀领兵五千出战，败还，大顺军只好弃武昌东下。从现有的材料来看，大顺军当时向东南方面进发，战线拉得比较长。南明江西等地总督袁继咸在三月下旬曾向朝廷报告：“闯贼下走蕲黄，上犯荆岳”。所以他当时派出署总兵邓林奇等增援蕲黄，自己则准备带副将汪硕画等领兵往江西袁州，防备大顺军由岳阳进入湘赣。
大顺政权由于没有留下较多的兵力扼守地方，又没有适时地组织必要的反击，只是一味地东进，这种顾前不顾后的做法终于招致了惨重的失败。四月，清军追至阳新富池口，趁大顺军不备冲入营垒，使大顺军又一次失利。同月下旬，在距江西九江四十里处被清军攻入老营，大顺军久历战阵、功勋卓著的大将刘宗敏被俘，军师宋献策、明降将左光先、李自成的两位叔父赵侯和襄南侯以及大批随军的将领家属也被清军俘获。刘宗敏和李自成的两位叔父当时就被杀害，宋献策和左光先却可耻地投降了。就在这前后，丞相牛金星认为大势已去，竟然不告而别，开了小差。牛金星的儿子牛佺原任大顺政权的襄阳府尹，在大顺军节节败退的情况下，也认贼作父，投降了清朝，被委任为黄州知府，后来又升任湖广粮储道。牛金星逃离大顺农民革命队伍后，一直住在牛佺的官衙里，享受着老太爷的清福，直至寿终正寝。“千古艰难惟一死，伤心岂独息夫人？”以一个封建落魄文人出身、被李自成委为文臣之首的牛金星所走过的生活道路确实是耐人寻味的。
大顺军在湖北阳新、江西九江连遭重大挫折之后，东下的去路已被清军截断，所掌握的数万艘船只也被清军掠夺一空，多铎部清军已由河南归德（商丘）、安徽泗州直趋南京，李自成原先的战略意图已无法实现。不得不掉头向西南方向进军，准备穿过江西西北部转入湖南。五月初，李自成行至湖北通山县境九宫山下，突然遭到当地地主武装袭击。当时跟随在他身边的只有义子张鼐和二十八名战士。地主武装见兵马不多，就一拥而上。二十八名战士先后被击杀，李自成也在搏斗中壮烈牺牲。关于李自成牺牲的情况，明末清初人士费密所著的《荒书》里有这样一段记载：
“自成亲随十八骑，由通山县过九宫山岭，即江西界。山民闻有贼至，群登山击石，将十八骑打散。自成独行至小月山牛脊岭。会大雨，自成拉马登岭。山民程九百者下与自成手搏，遂辗转泥滓中。自成坐九百臀下，抽刀欲杀之，刀血渍，又经泥水，不可出。九伯呼救甚急，其甥金姓以铲杀自成，不知其为闯贼也。武昌已系大清总督，自成之亲随十八骑有至武昌出首者，行查到县，九伯不敢出认。县官亲入山，谕以所杀者流贼李自成，奖其有功。九伯始往见总督，委九伯以德安府经历。”
关于李自成牺牲的地点和时间，各种史籍记载分歧很大。地点问题有通城说，通山说，辰州说，新昌说，等等。有的书说李自成并没有牺牲，而是病死于罗公山；甚至说他兵败以后遁往湖南石门县夹山寺，或湘黔交界的清水江畔野寺，或山西五台山当了和尚。史学界在一九五六年考证自成牺牲于湖北通山县，其说良是，兹不赘。时间问题，《明史》载于九月，他书或作四月、五月、六月、八月以至顺治三年，主张石门为僧说的人甚至认为“李自成”（即奉天玉和尚）圆寂于康熙十三年，但绝大多数都是依据传闻和推测。近年来，学者多倾向于五月说，但究竟在五月的哪一日，尚无定论。康熙四年《通山县志》载，“顺治二年五月初四，闯贼数万入县，毁戮四境，人民如鸟兽散，死于锋镝者数千，蹂躏三月无宁宇。”同书又说：“程九伯，六都人。顺治二年五月，闯贼万余人至县，蹂躏烧杀为虐，民无宁处。九伯聚众，围杀贼首于小源口。本省总督军门佟嘉其勇略，札委德安府经历。”与大顺军相比，程九伯等地主武装在力量上是微不足道的。当时的各种文献都说，他们之所以敢于向李自成及其随从发起攻击，是因为不知道出现在面前的这支小队伍就是声名赫赫的大顺军，更不知道其中就有大顺皇帝在内。何腾蛟在前引疏中就说，“闯势实强，闯伙实众，何以死于九宫山团练之手？诚有其故。”缘故就在于“乡兵初不知也。使乡兵知其为闯，气反不壮，未必遂能翦灭……。”所以，如果大顺军大队人马奔驰而来的话，这种局面是不可能出现的。比较合理的解释是，李自成带着近三十名随从，行进在大队人马之前（作为全军统帅也不可能距离大队太远），乡团练见来人不多才敢于上前寻衅。在刘姓伴当逃回报告“李万岁爷被乡兵杀死马下”的恶耗后，大顺军“满营聚哭”，部下将士对通山县一小撮地主武装立即实行报复性打击乃是必然之事。就是说，李自成的仓猝遇难，同大顺军在通山的“毁戮四境”应是同一天发生的事。如果这一推断能够成立的话，李自成牺牲的日期，可初步确定为顺治二年五月初四日。其他材料也有助于推断李自成遇难的日期。康熙《宁州志》载，大顺军攻克宁州是在五月十三日。江西宁州（今修水县）同湖北通山接境，大顺军在领袖遇难以后必然要经过一番料理，将近十天之后这部分大顺军才进抵宁州，也在情理之中。
李自成这位中华民族历史上最杰出的农民革命领袖牺牲了。他把一生献给了反对阶级压迫和满洲贵族民族征服的革命事业。在他领导下，受尽欺凌压榨的贫苦农民挺起了腰，抬起了头，向腐朽透顶的封建统治进行了勇猛的冲击，在广阔的土地上荡涤了地主阶级的污泥浊水，推翻了以朱由检为头子的明王朝。直到他牺牲时为止，他所领导的大顺军以大无畏的气概，独立地承担了抗清斗争的全部重任，为尔后二十年的抗清斗争揭开了序幕。以李自成为代表的明末起义农民们创建的丰功伟绩，将永远光照史册，受到后世人们的景仰。